COVID-19是由严重急性呼吸综合症冠状病毒2（SARA-CoV-2）引起的全球性流行疾病，人肺是SARA-CoV-2感染的主要靶器官，其特征包括从轻度综合症到严重肺损伤，甚至发展为呼吸衰竭，导致弥漫性肺泡损伤、肺炎和死亡。然而，COVID-19发病的深入机制尚不清楚，缺乏能够准确地模拟与人病毒感染反应相似的体外模型。
近期，中国科学院大连化学物理研究所秦建华研究员团队与中科院昆明动物研究所郑永唐研究员团队合作在AdvancedScience杂志上发表了“BiomimeticHumanDiseaseModelofSARS-CoV-2-InducedLungInjuryandImmuneResponsesonOrganChipSystem”文章，构建了人肺泡体外模型，重现了SARS-CoV-2体外诱导的肺损伤和免疫反应。该研究表明：SARA-CoV-2感染时，上皮细胞易感性高于内皮细胞；感染3天后，上皮细胞的天然免疫反应和内皮细胞依赖细胞因子的途径被激活，揭示了不同细胞类型的独特反应；免疫细胞在肺泡屏障受损和加重炎症中起到关键作用；药物雷米西韦可以抑制病毒复制，减轻肺芯片肺泡-毛细血管屏障的损坏。该肺芯片模型可以密切反应人类的相关反应，为COVID-19研究和药物开发提供了一个独特的研究平台。
根据世界卫生组织的报告，SARA-CoV-2是COVID-19的致病病毒，患者表现出多种临床特征，包括发热、干咳和毛玻璃样浑浊。根据活检标本，在肺间质组织和肺泡中观察到COVID-19可对单个核细胞或淋巴细胞进行炎症浸润。还有研究表明，由SARA-CoV-2引起的过度炎症细胞因子风暴往往导致异常的免疫反应甚至是死亡。然而深入的COVID-19的深入发生机制尚不清楚。
目前，SARA-CoV-2感染的研究模型主要依赖于细胞系或原代细胞的2D培养、动物模型。但这些模型都有其局限性。2D培养过于简单，不能表现出体内器官特异性微环境、器官的复杂结构和功能。SARA-CoV-2感染的动物模型，主要用来验证药物或疫苗的治疗效果，然而，由于物种的差异性，它们对SARA-CoV-2感染的目标器官或系统反应可能与人类有显著差异。此外，动物模型还要考虑到成本、时间和动物伦理等因素。因此，为更好地研究人体器官病理生理学，加速SARA-CoV-2的研究和增加COVID-19的候选疗法，开发替代临床前模型非常必要。
生物工程器官芯片技术的重大进展使体外重建三维人体器官模型成为可能，其主要方法是在微流控培养装置中构建人体器官的关键功能，如肠道、心脏、肝脏和肺等。它可以与人体器官的生理学相似，在疾病研究、药物测试和病毒学方面有巨大的潜力。Ingber小组成功地提出了一种肺芯片，它能够重建气液界面并应用于呼吸系统疾病，如肺水肿、哮喘和毒性评估；最近，肺芯片还试图研究流感病毒和假分型SARA-CoV-2宿主-病毒的相互作用，并用于筛选药物。
在人体内，肺泡是肺的核心功能单位，其中肺泡-毛细血管屏障在维持气体交换、防止外部危险物质和病毒侵袭方面起着至关重要的作用（fig1A）。这种功能屏障主要由人肺泡上皮细胞和血管内皮细胞组成，它们通过三维细胞外基质（ECM）相互作用。更多的临床证据表明：SARA-CoV-2感染可能损害重症患者的肺泡功能。为了建立体外SARA-CoV-2人肺感染模型，郑永堂和秦建华团队设计并构建了多层微流控培养装置来仿生人肺泡结构（以下简称肺芯片）。肺芯片由两个灌注通道（肺泡腔和血管通道）组成，夹有ECM修饰的PDMS多孔膜，人肺泡上皮细胞、肺微血管内皮细胞分别种植在PDMS多孔膜两侧。该装置通过协同人上皮-内皮细胞相互作用、三维ECM，再现人肺泡-毛细血管屏障的关键特征。该疾病模型为研究人类对传染病毒的反应提供了一个强大的微系统，为加速COVID-19有效治疗提供了一个研究平台。
SARS-CoV-2所致肺损伤及COVID-19相关的炎症反应原理图摘要
1.微工程人肺泡芯片的表征
肺芯片由两个灌注通道（肺泡腔和血管通道）组成，夹有ECM修饰的PDMS多孔膜（孔直径5μm）（fig1B），该多孔膜有利于物质扩散和上下细胞层之间的相互作用。人肺泡上皮细胞、肺微血管内皮细胞分别种植在PDMS多孔膜两侧，通道允许物质灌注、流动，可以促进养分交换和代谢产物去除。使用的细胞分别是：人肺泡上皮Ⅱ细胞（HPAEpiC）和肺微血管细胞（HULEC-5a），细胞被接种在多孔膜上下两侧3天后，流道内再以50μL/h的流速通入培养基，从而形成肺泡上皮-内皮组织界面。SARA-CoV-2暴露于肺泡腔通道，同时，人体免疫细胞通入到血管通道（fig1B）。
Fig.1SARA-CoV-2感染的肺芯片示意图及其表征
2.SARA-CoV-2感染肺芯片
据报道，人肺泡上皮Ⅱ型细胞是SARA-CoV-2的宿主受体，研究者试图确定肺泡上皮细胞对SARA-CoV-2的易感性。首先，分别检测了ACE2和TMPRSS2蛋白在HPAEpiC和HULEC-5a细胞中的表达，WB数据显示ACE2和TMPRSS2在两种细胞类型中均呈阳性表达，在HPAEpiC细胞中ACE2的表达高于HULEC-5a细胞（fig.2A）。为了进一步确定病毒感染后，ACE2和TMPRSS2蛋白在HPAEpiC细胞和HULEC-5a细胞中的表达，研究者利用单层细胞培养，分别感染了两个细胞，结果表明：与HULEC-5a细胞相比，HPAEpiC细胞中病毒NP蛋白的表达更高，表明肺泡上皮细胞对SARS-CoV-2感染的易感性高于肺微血管内皮细胞；病毒感染后两种细胞类型的ACE2和TMPRSS2蛋白表达水平没有明显变化（fig.2B），表明病毒感染对宿主细胞ACE2和TMPRSS2蛋白表达水平影响较小。在感染第3天，观察到超过20%的Spike蛋白阳性细胞（fig.2C）。为了进一步研究SARS-CoV-2感染细胞的超微结构，对模拟SARS-CoV-2感染的HPAEpiC细胞进行了透射电子显微镜（TEM）分析（fig.2DE），TEM图像显示模拟细胞表现出原始ATⅡ细胞形态特征，包括方形或圆形细胞大小（fig.2Dⅰ）、游离表面的微绒毛（fig.2Dⅱ）、细胞体内的片状体（fig.2Dⅲ）。在感染的细胞中，大量的病毒颗粒被检测到并分布在细胞簇中，证明了HPAEpiC细胞对SARS-CoV-2的易感性。
Fig.2SARS-CoV-2感染HPAEpiC细胞的检测
为了模拟SARS-CoV-2的肺泡感染，将病毒接种到芯片上的肺泡腔通道内，培养3天，HPAEpiC细胞和HULEC-5a细胞在多孔膜两侧形成汇合的细胞层（fig3AB）。在SARS-CoV-2感染的肺芯片中，观察到上皮细胞以表达Spike蛋白为主，显示病毒和上皮细胞大量增加，但是内皮细胞没有（fig3CD）。HPAEpiC细胞（E-cadherin）和HULEC-5a（VE-cadherin）的黏附连接蛋白组织没有明显变化，上皮细胞和内皮细胞的汇合率也没有明显变化（fig3EF）。这些结果表明，SARS-CoV-2主要在肺泡上皮细胞中感染和复制，但不能在内皮细胞中感染和复制。
Fig3SARS-CoV-2在肺芯片中的感染和复制特征
3.宿主细胞对SARS-CoV-2感染反应的转录分析
为了充分了解SARS-CoV-2感染的转录反应，研究者对肺芯片中病毒感染3天后的HPAEpiC细胞和HULEC-5a细胞进行RNA测序分析。首先，计算每个样本中病毒对齐读取与总读取的比率，估计这两种细胞类型中的病毒复制水平，结果表明，HPAEpiC细胞中病毒读取率远高于HULEC-5a细胞（fig4AB），这与WB（fig2B）和免疫染色分析（fig2D）结果一致。说明上皮细胞对SARS-CoV-2感染的耐受性高于内皮细胞，与尸检报告中的组织病理学结果相似。火山图显示，SARS-CoV-2感染诱导了HPAEpiC细胞核的转录组调节（fig4C）。两种细胞类型的差异表达基因中，个基因（个下调基因和个上调基因）在HPAEPIC细胞中显著调控，个基因（个下调基因和个上调基因）在HULEC-5a细胞中显著调控。结合这两个数据集，发现这两种细胞类型只共享52个重叠上调的差异表达基因(占总上调DEGS的6.2%)，只有43个重叠下调的差异表达基因(占总下调DEGS的5.5%)（fig4D）。这些结果表明，上皮细胞和内皮细胞SARS-CoV-2感染表现出明显的转录反应。为了更好的了解宿主对SARS-CoV-2感染的反应，进行了基因本体富集分析，以确定显著调控基因的富集过程。HPAEpiC细胞在有丝分裂细胞周期富集（fig4E），而HULEC-5a细胞，参与胞质分裂、转录因子活性过程被显著调节（fig4F）。
Fig.4肺芯片中HPAEpiC细胞和HULEC-5a细胞对SARS-CoV-2感染的转录分析
一般而言，病毒感染可以触发宿主细胞的免疫反应。为了确定SARS-CoV-2感染的特定宿主防御反应，研究者搜索上调的差异表达基因与免疫反应相关的基因。结果表明，SARS-CoV-2在两种细胞中具有明显的免疫应答。SARS-CoV-2感染诱导了广泛的天然免疫反应和抗病毒反应，包括对病毒的防御反应、I型干扰素(IFN-I)信号通路和细胞因子介导的HPAEpiC细胞信号通路(fig5A).然而，与JAK-STAT的正调控和适应性免疫反应有关的基因在HULEC-5a细胞中特别丰富（fig5B）。另外，在与免疫反应相关的上调基因中，研究者还发现了一些相关细胞因子，在HPAEpiC细胞中的IL-16、IL-11和CXCL11（fig5C），在HULEC-5a细胞中的CCL15-CCL14、CCL15和CCL23。
Fig5在共培养HPAEpiC细胞和HULEC-5a细胞中，RNA-seq分析显示了对SARS-CoV-2感染的独特免疫反应
4.SARS-CoV-2感染肺芯片后的免疫应答
免疫细胞在肺部的积累和浸润可能对呼吸道病毒感染患者的发病机制有显著的贡献。接下来，研究者探讨了人类循环免疫细胞在SARS-CoV-2感染肺泡过程中的作用。本研究从健康人血液中分离出PBMCs，并将其注入肺芯片中的血管通道，然后将SARS-CoV-2接种到肺泡腔孵育2天。在PBMCs存在下，Spike蛋白在肺泡上皮细胞中发现SARS-CoV-2感染感染（fig6A），连接蛋白E-cadherin和VE-cadherin在上皮细胞和内皮细胞中的分布分别受到强烈破坏（fig6B）。这些结果表明，在循环免疫细胞存在下，病毒感染导致肺泡屏障完整性收到损伤。PBMCs使内皮细胞的细胞相容性从90.31%±26.91%显著降低到45.92±8.52%（fig6BC），而上皮细胞的相容性无明显变化。这些数据表明，肺芯片在循环免疫细胞的存在下，内皮细胞发生了细胞脱离和损伤，揭示了免疫细胞在介导功能障碍中的关键作用。
更进一步，研究者检查了病毒感染后，芯片血管通道循环免疫细胞的变化。根据结果，研究者在内皮上观察到了单核细胞（巨噬细胞的天体细胞）（fig6DE），这与临床观察到的肺部炎症细胞浸润相似。研究者还在肺芯片上应用非特异性兴奋剂（IL-2、IL-6）来识别人类免疫细胞对这些刺激物的反应，表明炎症因子可能在宿主细胞对病毒感染的激活免疫反应中起关键作用。为进一步探讨SARS-CoV-2在该模型系统中诱导的炎症反应，研究者评估了血管通道中培养介质中促炎细胞因子的释放。在感染第2天，没有PBMCs的情况下，IL-6和IL-8的水平显著提高（fig6GH）。此外，加入PBMCs，所有四种细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8和TNF-)在SARS-CoV-2感染后均明显增加(fig6F-I)。特别是，相比没有感染的组，病毒感染引起的IL-1和IL-6水平在培养基中从下内皮层增加了十倍(fig6FG)。显然，肺芯片感染SARS-CoV-2后可以诱导PBMCs的蓄积，并加重肺组织中的炎症反应，和临床结论相同，进一步证明肺非芯片可以用于COVID-19相关研究的可行性。
Fig6循环免疫细胞存在或不存在的情况下，共培养上皮和内皮对SARS-CoV-2感染的反应分析
5.潜在抗病毒疗法的评估
为了探索SARS-CoV-2感染的潜在治疗方法，研究者用雷米西韦处理病毒感染的肺芯片，雷米西韦被认为是一种很有前途的抗病毒化合物。本研究中，雷米西韦的指示剂量时1x10-6M，将SARS-CoV-2加入单层HPAEpiC细胞中，给药3天后，收集上清液，用实时定量PCR测定病毒滴度。给药后，感染病毒滴度明显下降（fig7A）。随后，测试了雷米西韦作用在病毒感染芯片上的效果，并在血管通道中加入PBMCs，与fig6B、C结果相反，说明，雷米西韦可以在一定程度上恢复上皮层和内皮层的损伤（fig7BC）。这些结论表明雷米西韦在抑制SARS-CoV-2复制和减轻病毒诱导的肺泡-毛细血管屏障损伤中具有潜在作用。
Fig7在肺芯片上雷米西韦的潜在抗病毒效果评价
这项工作首次建立了一个SARS-CoV-2感染的人肺泡芯片模型，在该模型上重现了病毒感染后的肺损伤和免疫反应。该肺芯片实现了多细胞共培养、组织-组织界面、循环培养和循环免疫细胞，缩小了体外模型和人体器官生理病理之间的差距。该模型可以在器官水平上研究宿主-病毒之间的相互作用，可以同时研究各种细胞对病毒的反应，具有低成本和短时间快速测试候选药物的优势，为当前COVID-19大流行病的研究提供新的研究平台。
Zhang,M.,P.Wang,R.Luo,Y.Wang,Z.Li,Y.Guo,Y.Yao,etal.BiomimeticHumanDiseaseModelofSars-Cov-2InducedLungInjuryandImmuneResponsesonOrganChipSystem.AdvSci(Weinh)(Oct):.